双荧光素酶报告基因系统是一种广泛应用于生物医疗研究的技术，主要用于探索基因表达调控、蛋白质相互作用和信号通路。自1990年问世以来，该技术经历了三十多年的发展。1993年，首个荧光素酶专利获批，1996年推出了双荧光素酶报告基因检测系统，此后在生物医学领域得到了广泛应用。
系统原理
双荧光素酶系统通常使用两种不同来源的荧光素酶，北美萤火虫（Photinus pyralis）的荧光素酶和海肾（Renilla reniformis）来源的荧光素酶最为常见。前者编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，分子量62kDa，具有直接可检测的酶活性；后者则为催化腔肠素发生荧光反应的特异性单亚基蛋白，分子量为36kDa，具备同样的催化活性。
实验步骤
实验包括以下步骤：
- 报告基因质粒构建：将目的基因片段插入荧光素酶表达载体中。
- 细胞转染：将报告基因质粒和内参质粒共转染细胞，通常为48小时。
- 细胞处理：根据实验需求处理细胞。
- 细胞裂解：使用裂解液对细胞进行裂解。
- 荧光值测定：加入荧光素，测定不同荧光素酶的荧光值。
- 数据分析：计算相对荧光素酶活性并进行统计分析，评估组间差异的显著性。
应用场景
双荧光素酶报告基因系统具有多种应用场景，包括：
- 尊龙凯时的miRNA与靶基因互作研究，例如验证miRNA与mRNA、lncRNA之间的相互作用。
- 转录因子与启动子的相互作用研究，分析转录因子对基因表达的调控。
- 启动子活性分析，验证启动子的表达模式及强度。
- 启动子SNP分析，探讨单核苷酸多态性对基因表达的影响。
- 研究细胞内信号通路的激活和传导情况。
- 用于高通量药物筛选以评估药物对基因表达的影响。
常见问题及解决方法
在实验过程中，可能会遇到以下问题：
- 如果荧光值过高，可能超出仪器检测范围。可以通过减少质粒转染量或对裂解产物进行稀释来解决。
- 实验结果不稳定，可能由细胞状态、转染效率或加样准确性等因素造成。确保细胞在对数生长期，一致的转染效率及定期校准移液器。
- 荧光素酶作为报告基因较之荧光蛋白具有更高的灵敏度和更宽的动态范围，适用于各种生物医学应用。
综上所述，双荧光素酶报告基因系统为生物医疗领域的研究提供了可靠的实验工具，尊龙凯时致力于为科研工作者提供高质量的研发支持与服务。
